심혈관계 질환의 유전자 치료

(Gene Therapy for Cardiovascular Disease)

변 종 회

(Jonghoe Byun, PhD)

삼성생명과학연구소

성균관대학교 의과대학

Tel: 02-3410-6827

Fax: 02-3410-6829

e-mail: jonghoe@smc.samsung.co.kr

2004년 대한순환기학회 춘계 학술대회

시간: 2004. 4. 16. (금) 17:00-17:20

장소: 제주 롯데 호텔 제 2 회의장

머 리 말

합리적인 치료법으로 21세기 의술의 꽃으로까지 기대되던 유전자 치료가 최근 불거진 암유발가능성의 제기와 기술적인 한계들도 인해 고전을 면치 못하고 있는 실정이다. 병의 결과를 치료하는 것이 아니라 그 원인을 유전자를 이용하여 직접 치료한다는 이론상의 완벽함에도 불구하고 현실적인 한계들은 여전히 이 분야의 발목을 잡고 있다. 그동안의 문제였던 유전자 전달 효율, 특이적인 발현, 벡터의 안정성, 독성, 사회/윤리적 파장들 이외에 최근 또 다른 문제들이 제기되어 이 분야를 긴장시키고 있다. 실제로 최근 human genome project의 결과에 의하면 예상보다 훨씬 적은 3만여개의 유전자들만이 발견되어, 복잡한 인간의 생명현상 뒤에는 유전자이외의 다른 요인들도 중요할 수 있음을 주장하는 proteomics와 epigenetics 등의 분야가 점차 설득력을 키워가고 있다. 초기 기대가 컸던 만큼 그 실망감도 비례하여 크지만, 여전히 유전자가 생명현상의 청사진을 담고 있다는 점을 감안할 때 유전자 요법은 세포 치료법과 함께 분자의학시대의 궁극적인 치료법으로 자리잡게 될 것으로 사료된다. 이번 발표에서는 유전자 치료의 이론과 이 분야가 앞으로 나아갈 방향/향후 전망 등을 재조명하고 (본 논문), 심혈관계 관련 유전자 요법 연구를 몇몇 실례들을 중심으로 살펴보고자 한다. (당일 발표).

1. 유전자 요법의 정의 (Definition of Gene Therapy)

유전자 요법은 ‘외부에서 유전자를 도입하여 1) 결손된 유전자를 교정시켜주어 원래의 정상 상태로 바꾸거나 2) 세포에 새로운 기능을 제공하여 질병을 치료하고자하는 기술’로 정의될 수 있다. 실제적으로는 질병의 치료나 치료 모델을 개발하기 위해 유전자 또는 유전자가 이입된 세포를 사람의 체내로 투입하는 제반기술로 다시 정의될 수 있다. 이 치료법은 현대 생명과학의 최신 이론과 기술들이 접목된 분야로서 유전학, 생화학, 분자생물학, 바이러스학, 세포생물학, 면역학, 종양학, 병리학, 약학, 임상의학 등 생명 현상에 관련된 모든 지식과 도구들이 총망라되는 종합과학적 성격을 지닌다. 유전자 요법에 관한 몇몇 정의들을 모아보면 다음과 같다.

"The treatment of disease by either replacing damaged or abnormal genes with normal ones, or by providing new genetic instructions to help fight disease, e.g., cancer. "

- American Society of Gene Therapy -

DNA 재조합 방법을 이용하여 새로운 유전자를 환자의 세포 안으로 도입시켜 유전자 결함을 교정시키거나 세포에 새로운 기능을 추가시켜 인체 세포의 유전적 변형을 통해 암, 감염성 질병, 그리고 자가면역질환 등과 같은 유전자 결함을 치료하거나 예방하는 방법

- 차세대 생물산업 핵심기술 사업단 -

"The treatment of human disease by transfer of therapeutic genetic material into specific somatic cells of a patient instead of using conventional drugs"

- Wolff, Lederber & Mulligan -

"A treatment procedure whereby a therapeutic gene is inserted into a patient's somatic (body) cells in an attempt to treat a disease."

- W. French Anderson

"A strategy whereby nucleic acid, usually in the form of DNA, is administered into somatic cells to correct or replace a genetic defect or to modify the genetic properties of cells by, for example, producing therapeutic or immunostimulatory proteins.

- Τeija Parpala-Sparman -

2. 역사 (History)

유전자 요법의 이론적 골격은 retrovirus에 대한 이해의 증진과 더불어 1980년대 초반에 구축되었다. Retrovirus genome의 일부를 외부유전자(transgene)로 대치시킬 수 있음이 밝혀지면서 각종 세포 및 조직으로의 유전자 전달 연구가 본격화되기 시작하였고, 사람을 대상으로 한 유전자 투입실험은 1989년 5월 22일 미국의 Rosenberg 박사팀(NIH)이 neo 유전자를 이용하여 marker study를 실시한 것이 처음이다. 그러나 치료목적의 유전자 요법은 Anderson, Blease, Culver 등이 1990년 9월 14일 면역결핍증 환자에게 ADA 유전자를 투여한 것이 그 효시라 할 수 있다. 그 후 미국, 영국, 프랑스, 독일, 이탈리아, 네덜란드, 중국, 스위스, 스웨덴, 오스트리아, 일본 등 세계 각국에서 유전자 요법을 시행하기 위한 노력이 진행되어 왔고 최근 우리나라에서도 KFDA의 허가를 받은 유전자 요법 임상시험 연구가 진행 중에 있다.

유전자 요법 개발사에 있어 중요한 이정표들은 다음과 같다.

Milestones in Gene Therapy & Recombiant DNA technology

1865  Μendel's Law of Genetics

1871	Discovery of DNA (Trout sperm)

1943	DNA is a genetic material (altering the heredity of bacteria)

1953	Double helical structure of DNA (complementary)

1956	Genetic messages of DNA are conveyed by its sequence

of base pairs

1965	Genes conferring antibiotic resistance are often carried on

plasmids

1966	Establishment of the complete genetic code

1970	First attempt at gene therapy: Stanfield Rogers administered

the Shope papilloma virus to two German girls suffering from

argininemia.

Unsuccessful clinical trial performed before the existence of

Institutional Review Board. No actions were taken against

those involved.

1972	Generation of the first recombinant DNA molecule

1973	Foreign DNA inserted into plasmids (potential for cloning in

bacterial)

1973	First public concern toward recombinant DNA procedures

1974	Formation of the NIH RAC (Recombinant DNA Advisory

Committee)

Call for a moratorium on certain recombinant DNA experiments

1976	Release of the first guidelines (NIH, many restrictions, rising

concern)

1977	First genetic engineering company (Genentech)

DNA sequencing method developed

1977	Creation of the first recombinant DNA containing mammalian

gene.

1978	Nobel Prize awarded for the discovery and use of restriction

enzymes

1978	First human hormone(somatostatin) produced by recombinant

DNA

1979	General relaxation of the NIH guidelines (study of viral DNA)

1979	Study of cancer gene by transformation assay

1980	Second attempt at gene therapy: Martin Cline tried to treat

β-thalassemic patients with normal hemoglobin gene.

Less clearly defined regulatory and approval processes,

NIH & UCLA sanctions

1980	Nobel Prize awarded dually for the creation of the first

recombinant DNA molecule and the development of DNA

sequencing methods

1981	Offer to the general public of stock in the first recombinant

DNA company (Genentech).

1981	Exemption of gene cloning experiments using laboratory strains

of E. coli and yeast as hosts for propagation of recombinant

DNA

1982	Further wholesale relaxation of the NIH guidelines

"Supermice" created

'Humulin' - human insulin produced by recombinant DNA

methods goes on the market

1985	PCR & Human Genome Project emerged

1987	First human genetic linkage map

1989	First human gene marking trial (NeoR/TIL)

1990	Fisrt human gene therapy trial (ADA deficiency)

1999  Death of a patient (Jesse Gelsinger Case)

2000  Successful human gene therapy of SCID-X1 in France

2001	The first working draft of the human genome

2002	Leukemia-like side effects of gene therapy reported

2003	US halts 27 similar gene therapy trials.

2003	Completion of Human Genome Project

2003  DNA double helix 발견 50주년

3. 유전자 요법의 전략들 (Potential strategies of gene therapy)

3.1  Gene augmentation

외부 유전자를 질환세포에 전달하는 방법으로 expression cassette을 통해 치료유전자를 발현시켜 치료효과를 얻을 수 있다. 대부분의 gene transfer 연구가 DNA add-back type으로 여기에 해당된다. Monogenic recessive diseases (e.g., cystic fibrosis, hemophilia, muscular dystrophy 등)가 대상질환으로 많이 시도되어 왔다. 경우에 따라서는 정상형질보다 많은 수의 gene copy가 존재해 대사물질이 정상수준보다 높을 수가 있다.

3.2 Gene correction (modification)

In situ에서 defective gene을 normal gene으로 바꾸거나, 정상적으로 작동하도록 고쳐주는 방법이다. Chimeraplasty 등을 통해 point mutation등을 치료할 수 있다.

3.3 Gene replacement

질병유전자를 도려내고 치료유전자를 물리적으로 대체시키는 방법으로 일종의 gene surgery이다. Trans-splicing ribozyme 등이 이런 일을 감당할 수 있다.

3.4 Gene activation/suppression

내부유전자(structural gene)를 제어하는 조절유전자(control element)를 세포에 전달하여 활성화내지 억제시킴으로써 치료효과를 얻는 방법이다.

3.5 Gene ablation (targeted cleavage & inactivation)

종양이나 감염질환의 경우 병유발 유전자를 분해 및 무력화시킴으로써 치료효과를 얻는 방법이다. Hammerhead ribozyme 등을 이용해 특정 HIV RNA를 절단할 수 있고, antisense oligomer 혹은 siRNA등을 통해 특정 유전자의 기능을 억제할 수 있다.

3.6 Targeted killing of specific cells

Prodrug metabolizing enzymes (PDME)을 이용해 특정세포에서만 prodrug를 toxin으로 변형시켜 살상효과를 얻는 방법이다. PMDE는 열가지가 넘지만, 대표적인 것들로는 thymidine kinase (TK), cytosine deaminase (CD), P450-2BI system, bacterial nitroreductase system 등이 있다. 또한 종양부위에서만 특이적으로 증식할 수 있게 만든 oncolytic adenovirus도 이 분야에 해당된다.

4. 대상 질병 (Target diseases)

정의상 유전자가 관계된 모든 질병이 대상이 될 수 있다.  생명현상에는 필수적으로 유전자가 관여하므로 실제적으로 거의 모든 질환이 유전자 요법의 대상이 될 수 있다. 초기 유전자 요법의 개념이 도입될 때는 한개의 유전자가 결핍되어 생기는 유전병(ADA deficiency, cystic fibrosis, hemophilia etc), 즉 대사이상질환을 치료하는 것이 목적이었으나 현실적인 면에서는 환자수 및 기존치료의 한계점 등에 기인하여 암과 AIDS 등의 감염성질환이 주된 치료 대상이 되어왔다. 최근에는 기존치료법에 비해 치료효과면에서 상대적 우위를 지닐 수 있는 순환기계 질환 및 면역계 질환, 내분비 질환, hematological malignancy, pulmory and neurological disease 등에 대한 치료법도 많이 개발되고 있다. 더 나아가 환자의 삶의 질을 높혀줄 수 있는 곳, 예를 들어 관절염의 치료 등에도 유전자 요법이 도입되고 있다. 또한 질병예방의 백신목적으로도 유전자전달이 이용되기도 한다.

5. 치료 유전자의 형태

가장 많이 사용되는 유전자의 형태는 DNA이고, RNA도 사용될 수 있다. 특수한 경우에는 RNA/DNA의 chimera나, PNA (peptide nucleic acid) 등이 사용되기도 한다. 또 유전자의 안정성을 높이기 위해 chemical modification을 수행하기도 한다.

6. 치료유전자의 유형 (Therapeutic gene)

6.1 Structural gene

결함유전자와 동일한 구조유전자 혹은 새로운 기능을 제공하는 다른 구조유전자를 전달하여 단백질이 발현됨으로써 치료효과를 나타내게 된다.

6.2 Control elements

구조유전자를 suppression시키거나 activation시킬 수 있는 유전자들로서 transcription factor나 signal transduction pathway상의 유전자들이 많이 이용된다.

6.3 Anti-sense complementarity

특정 목표 DNA 및 RNA에 결합하여 그 활성을 억제시키거나 제거할 수 있는 형태의 유전자. Antisense oligo나 siRNA등이 이부류에 해당된다.

7. 유전자 전달체 (Gene delivery vehicles)

유전자 요법의 핵심기술중의 하나는 외부 유전자를 효과적으로 세포내로 전달하여 안정적으로 발현시키는 전달매체라 할 수 있는데, 이 도구들에는 크게 Biological vector와 Physico-chemical method가 있다. Biological vector로는 retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, HSV, vaccinia 등의 다양한 DNA/RNA virus들이 vector로 개발되어 있고, Physico-chemical methods로는 리포좀, 미세유리관 주입, 전기충격, 금속입자, 인산칼슘/DEAE-dextran 등과 같이 외부 DNA가 세포내로 잘 들어갈 수 있는 물리/화학적 환경을 만들어주는 물질들이 있다. 현재까지는 레트로바이러스 벡터와 adenovirus vector가 가장 많이 사용되어 왔으나, 앞으로는 대상 질병 및 유전자, 부위, 치료 전략 등에 따라 각기 적합한 벡터가 주문 제작되는 형식을 취하게 될 것이고 좀더 안정성 위주로 벡터들이 개발될 전망이다. 최근에는 naked plasmid와 electroporation, femtosecond laser, ultrasound 등의 물리화학적기기를 결합하여 유전자 전달효율을 극대화시키는 연구들도 많이 진행되고 있다.

8. 유전자의 전달 과정 (Process of gene transfer)

외부에서 생체로 유전자를 전달하는 방법은 크게 직접 생체내로 주입하는 in vivo approach와 생체조직에서 세포를 분리한 후 이 세포에 유전자를 전달한 후 증식시켜 생체로 재주입하는 ex vivo approach가 있다. 이 두 방법 모두 궁극적으로는 세포의 핵안으로 유전자가 전달되어야 한다는 점에서 다음과 같은 공통된 장애물들이 있다. 먼저 1) target cell에 접근하여 binding되어야 하고, 2) cytoplasmic transport과정을 거쳐 살아남아야 되며, 3) 핵내로 유전자가 전달되어, 4) 안정적으로 발현되어야 한다. 특히 in vivo의 direct injection의 경우는 plasma membrane, endosome, nuclear envelope등의 장애물에 추가적으로 외부적인 tissue & immunological barrie도 통과해야 한다

유전자 주입경로에 따른 tissue 와 cell targeting도 중요하다. 한 예로 혈관내로 주입시 (intraarterial, intraveinous) 치료유전자가 목표장기의 목표세포에만 가도록 하는 방법으로 receptor-ligand interaction이나 항체 등을 이용할 수도 있고, 이중 안전장치로 tissue-specific promoter를 사용하여 다른 장기에서는 발현을 막는 전략을 구사할 수도 있다. 일부 바이러스 벡터의 경우에는 거죽의 단백질 등을 변형시켜 tissue tropism을 바꾸기도 하고, 또 일부 감염이 안되는 세포는 동종 혹은 이종의 바이러스로 향후 감염심킬 바이러스의 receptor를 미러 넣어주어 감염효율을 증대시키기도 한다. Ribozyme이나 antisense oligomer 등은 핵 내에서 target nucleic acid에만 작용하도록 하는 targeting specificity도 중요하다.

9. 전달된 유전자의 발현 조절과 안정성, 그리고 면역 반응

유전자의 발현을 조절할 수 있는 gene switch system의 대표적인 것들로는 tetracycline, ecdysone, RU486 등을 이용한 system 들이 있고 이들과 다른 방법으로 Cre-LoxP도 많이 쓰인다. Drug나 hormone을 이용하여 비교적 tight regulation이 가능하고 우리가 원하는 수준으로 유전자 발현을 조절할 수 있다. 그러나 전달된 유전자가 환자의 생존기간 내내 계속 안정적으로 발현될 수 있는 지에 대해서는 회의적인 시각이 많다. 바이러스를 이용하여 유전자를 전달하였을 때는 일정기간 후에 유전자가 존재함에도 발현이 저하되는 현상이 관찰되기도 하고, 이런 gene silencing 이외에도 생체 내에서는 illegitimate recombination 및 physical rearrangement도 일어나기 때문에 이 안정적 발현 및 물리적 안정성 부분에 대해서는 많은 연구가 필요하다. 최근 비교적 위험논의에서 제외됐던 AAV vector가 liver cell에서 integration 되고 host chromosome의 deletion을 유발한다는 보고는 이런 점에서 시사하는 바가 크다.

전달된 유전자의 안정적 발현에는 유전자가 전달된 세포의 안정성도 중요하다. 전달벡터에 의한 면역반응이나 전달 유전자에 의해 유발된 면역반응은 결국 세포를 제거하여 치료전략이 허사로 끝날 수 있기 때문이다. 일부 바이러스벡터는 면역반응과는 별개로 그 자체로 세포 독성을 지니기도 한다.

10. 성공적 유전자 요법의 요건들

성공적인 유전자 요법을 위해서는 1) 목표질환에 대해 잘 알아야 되고, 2) 전달할 유전자의 구조와 기능을 파악해야 하며, 3) 높은 효율 (high transfer efficiency + specific targeting)로 유전자를 전달하고, 4) 전달된 유전자의 발현조절이 가능해야 하며, 5) 벡터나 치료유전자에 따른 면역반응이 없거나 제어가능해야 하며, 6) 전임상연구로 동물실험에서 충분한 안정성과 치료효과가 검증된 후, 7) 잘 설계된 임상시험을 통해 환자에서의 안전성, 치료 가능성, 위약효과 등이 검증되어야 한다.

11. 유전자 요법의 문제점

1990년대 중반까지 유전자 요법의 최대 현안은 유전자 전달 효율의 극대화였다고 말해도 과언이 아닐 것이다. 그러나 1999년 Jesse Jelsinger case 이후 안전성 및 임상시험 감독관리에 대한 대중적 관심이 높아졌고, 2002년 프랑스에서의 leukemia-like side effects와 그에 따른 30여건의 관련 임상시험의 중단은 유전자 요법 분야의 큰 악재로 작용하고 있다.  이런 난관을 극복하기 위해서는 좀 더 기초적인 연구가 필요하다. 첫째, 벡터들, 특히 바이러스 벡터들의 독성과 chromosome내 삽입 가능성과 그에 따른 영향들을 면밀하게 검토하여야 하며, germline integration 여부, replication-competent virus의 유무,  유전자 전달 후 host 내 recombination 유무 등도 좀더 상세히 조사하여야 할 것이다. 둘째, 면밀한 전임상시험 연구가 진행되어 넣어주는 유전자의 안정성과 생체 내 분포, 가능한 제거 방법 등에 대한 지식 등도 얻어져야 할 것이다. 셋째, 유전자 치료가 갖는 사회/윤리적 문제들에 대한 교육과 준비도 과학 못지않게 중요한 부분일 것이다.

12. 결론 및 전망

유전자 요법에 거는 의학계의 기대는 지대하다. 현재 암, AIDS, 유전병, 신경계 질환 등의 많은 선‧후천적 난치병들은 기존의 치료법으로 만족할 만큼의 치료효과를 거두고 있지 못한 바, 유전자 요법이 이에 대한 새로운 대안이 될 수 있다. 그러나 유전자 요법에 대한 이런 많은 희망과 가능성에도 불구하고 아직 넘어야 할 고개들은 많다. 유전자를 전달하는 도구들에 대한 안정성과 효율성이 더욱 강화되어야만 하고, 대상질환에 대한 병리/생리학적인 지식이 많이 축적되어야 하며, 많은 동물실험을 통한 생체 효과의 증명과 기타 부작용에 대한 연구가 선행되어야만 한다. 임상시험을 수행할 때에는 사회적/윤리적/법률적 측면을 충분히 고려한 제도적 장치도 뒷받침되어야 할 것이다.

결론적으로 유전자 요법은 이론상으로는 간단하지만, 실제로는 매우 많은 노력과 시간을 필요로 하는 어려운 치료법이다. 최근의 악재들이 이 분야를 더욱 어렵게 하고 있지만, 생명현상의 청사진과 기록이 결국은 DNA에 있기 때문에 유전자 요법은 분자의학시대의 궁극적인 치료법이 될 것으로 확신하는 바이다.

13. References

1. James W. Larrick & Kathy L. Burck (1991) Gene Therapy: Application of Molecular Biology (Elsevier).

2. Nancy Smyth Templeton & Danilo D. Lasic (2000) Gene Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies (Marcel Dekker).

3. Marina Cavazzana-Calvo, Adrian Thrasher, and Fulvio Mavilio (2004) The future of gene therapy: balancing the risks and benefits of clinical trials.

4. http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical